Molekularne biološke metode istraživanja i njihova primjena

Molekularne biološke metode istraživanja igraju važnu ulogu u modernoj medicini, forenzičke znanosti i biologije. Zahvaljujući napredak u istraživanju DNA i RNA, osoba može istražiti genom organizma utvrditi uzročnika, prepoznati željenu nukleinsku kiselinu u smjesi kiseline, itd

Molekularne biološkim metodama. Što je to?

Povratak u 70-80s od znanstvenika bio je prvi dešifrirati ljudski genom. Ovaj događaj je dao poticaj za razvoj genetskog inženjeringa i molekularne biologije. Studij svojstava DNA i RNA je značilo da je sada moguće koristiti ove nukleinskih kiselina u svrhu dijagnosticiranja bolesti, studija gena.

Priprema DNA i RNA

Molekularno biološke dijagnostičke metode zahtijevaju polazni materijal: često ovaj nukleinske kiseline. Postoji nekoliko načina za odabir tih tvari iz stanice živih organizama. Svaki od njih ima svoje prednosti i mane, i to treba uzeti u obzir prilikom odabira metode izolaciju nukleinskih kiselina u čistom obliku.

1. Priprava DNA Marmur. Postupak se sastoji u liječenju smjese alkohola tvari taloži Dobivena čista DNA. Nedostatak ove metode je korištenje nagrizajuće tvari, fenola i kloroforma.

2. Izolacija DNA na grede. Glavna supstanca koja se ovdje koristi - je gvanidin tiocijanata (GuSCN). To potiče taloženje dezoksiribonukleinske kiseline na specijalizirane podloge, od kojih se može naknadno prikupljenim pomoću posebnog tampon. Međutim GuSCN - inhibitor TCP, pa čak i mali dio koji se taloži u DNA može utjecati na tijek reakcije polimeraze lanca, što je važno kada se radi s nukleinskim kiselinama.

3. Nakon taloženja nečistoća. Postupak se razlikuje od prethodnih, da molekula sami nisu deponirane dehoksiribonukleinovoy kiselina i nečistoća. Da biste to učinili, koristite ionske izmjenjivače. Nedostatak je da nisu svi tvari mogu riješiti.

4. misa probir. Ova metoda se koristi u slučajevima kada ne trebate imati točne podatke o strukturi DNA molekule, i potrebu da se neke statistike. Razlog je da se struktura nukleinska kiselina može oštetiti prilikom rukovanja deterdženti, osobito lužine.

Klasifikacija metoda istraživanja

Svi molekularno-biološke metode istraživanja su podijeljeni u tri glavne skupine:

1. Pojačanje (korištenjem više enzima). To uključuje PCR - lančana reakcija polimeraze, koji igra važnu ulogu u mnogim dijagnostičkim postupcima.

2. Neamplifikatsionnye. Ova skupina metoda je povezana izravno s radom mješavina nukleinskih kiselina. Primjeri 3 vrste blot, in situ hibridizacija, itd

3. Postupci se temelje na prepoznavanju signala iz sonde molekule koja se veže na specifične DNA ili RNA probom. Primjer - hibridizacija sustav hibridne otopina Capture System (hC2).

Enzimi koji se mogu koristiti u molekularno biološkim metodama istraživanja

Mnoge dijagnostičke tehnike molekularne uključuju korištenje širokog raspona enzima. U nastavku se koriste najčešće:

1. restrikcijskog enzima - „cut” molekule DNA potrebnim dijelovima.

2. DNA polimeraza - sintetizira molekule dvolančane deoksiribonukleinske kiseline.

3. reverzne transkriptaze (reverzne transkriptaze) - koristi se za sintezu DNA iz RNA predloška.

4. DNA ligaza - je odgovoran za formiranje fosfodiesterskih veza između nukleotida.

5. egzonukleaze - uklanja nukleotida sa krajnjim dijelovima molekule deoksiribonukleinske kiseline.

PCR - osnovni postupak za umnožavanje DNA

Lančana reakcija polimeraze (PCR) se često koristi u suvremenoj molekularne biologije. Ovaj postupak, u kojem jedna molekula DNA može se dobiti velik broj kopija (pojačanje molekule).

Glavne funkcije PCR:

- dijagnoza bolesti;

- kloniranje DNA segmente, Gene.

Provesti polimeraza lančana reakcija zahtijeva sljedeće elemente: početni DNA molekula, termostabilna DNK polimeraza (Taq ili Pfu) deoksiribonukleotidna fosfate (izvori dušikovih baza), klica (2 klica 1 molekula DNA) i sama puferski sustav koji može provesti Sve reakcije.

PCR se sastoji od tri koraka: denaturacije, početnice žarenja i istezanja.

1. denaturacija. Na temperaturi od 94-95 stupnjeva Celzija proshodit razbiti vodikove veze između dva lanca DNA, a kao rezultat toga smo dobili dvije jednolančane molekule.

2. žarena primera. Na temperaturi od 50-60 stupnjeva Celzijusa nastaje pristupnih klica na krajevima molekula jednolančane nukleinske kiseline prema vrsti komplementarnosti.

3. Istezanje. Na temperaturi od 72 stupnjeva je sintetiziran kćeri dvolančane molekule deoksiribonukleinske kiseline.

sekvenciranje DNA

Molekularno biološke metode istraživanja često zahtijevaju znanje o slijedu nukleotida u molekulu deoksiribonukleinske kiseline. Da bi odredili genetski kod poredan. Molekularna dijagnostika u budućnosti će se temeljiti na znanja stečena u određivanju ljudske sekvence.

Sljedeće vrste redoslijed:

• sekvenciranje od Maxam-Gilbert;
• Sanger sekvenciranje;
• pyrosequencing;
• nanoporovoe sekvencioniranje.